В капле гниющей жидкости перед взором любознательных микроскопистов открывался неведомый мир разнообразных мельчайших существ. В одном и том же поле зрения микроскопа виднелись и быстро пробегающие клетки простейших животных, и одноклеточные растения с длинными жгутиками, и медленно двигающиеся, постоянно изменяющие форму своего тела амёбы, и более мелкие, извитые наподобие штопора нити, и мельчайшие шарики и палочки, форму и строение которых уже почти не удавалось рассмотреть.

Трудно было разобраться во всем этом многообразии форм, и совсем немыслимо было изучать в этой смеси биологию каждого отдельного представителя микробного мира.

Для того, чтобы подробно изучить жизнедеятельность отдельного микробного вида, его цикл развития, его физиологические функции, необходимо было изолировать его из всей массы различных организмов и пересадить в свежую питательную среду, в которой он мог бы размножаться, как теперь говорят, в чистой культуре, т. е. без примеси других организмов.

Для этого нужно было так приготовить питательную среду, чтобы она не содержала других посторонних зародышей. Среда должна была быть обеспложена, простерилизована^[3].

Микробиологи той эпохи еще не были знакомы ни с методами изолирования микробов в чистые культуры, ни с методами приготовления обеспложенных — стерильных питательных сред.

Пастер первый научил нас приготовлять вполне обеспложенные питательные среды; колбы и пробирки он закрывал ватными пробками и стерилизовал сухим жаром при 150°—170° (рис. 20). После стерилизации сосуды наполнялись питательным мясным бульоном и кипятились. После кипячения бульон оставался стерильным, так как зародыши убивались нагреванием, а ватная пробка, хорошо пропускающая воздух, являлась вместе с тем надёжным препятствием для микробов, оседавших в её толще.

Рис. 20. Сушильный шкаф для стерилизации стеклянной лабораторной посуды:

а — внешний вид; б — схема устройства

Правда, некоторые бактерии, обладающие спорами, выдерживают кипячение в течение нескольких часов. Чтобы убить споры, приходится нагревать питательные среды при более высокой температуре — 125°, которая создаётся добавочным давлением в автоклаве. Аппарат, стерилизующий под давлением, — автоклав, — который теперь применяется для обеспложивания во всех микробиологических лабораториях, был внедрён в конце прошлого столетия в бактериологическую практику русским врачом Гейденрейхом.

Существуют питательные среды, которые изменяют свой химический состав при нагревании в автоклаве. Для таких сред был разработан метод так называемой дробной стерилизации, позволяющий добиться полного обеспложивания путём трёхкратного кипячения при температуре 100° с промежутком в одни сутки. Этот метод основан на том, что споры, не убитые при первом кипячении, прорастают, теряя тем самым стойкость к нагреванию, и убиваются при повторных прогревах.

Те же жидкости, которые совершенно не выдерживают нагревания, стали обеспложивать процеживанием через мелкопористые фильтры, сделанные из угля, асбеста и каолина, инфузорной земли. Если пропустить жидкость, содержащую микробы, через такой фильтр, то даже самые мелкие бактерии прилипнут к порам фильтра и застрянут в них. Жидкость окажется обеспложенной. Только самые мельчайшие микробы — фильтрующиеся вирусы — пройдут через такой фильтр. Пройдут через фильтр также и жизнеспособные частицы бактериальной клетки, так называемые фильтрующиеся формы бактерий.

Таким образом, сейчас в распоряжении микробиолога имеется целый ряд способов получения обеспложенных стерильных питательных сред.

Как же вырастить в такой среде чистую культуру микроба, т. е. культуру, происходящую из одной единственной клетки интересующего нас вида? Как выделить нужную нам клеточку диаметром в несколько тысячных долей миллиметра из смеси миллиардов особей, населяющих разводку микробов в жидкой среде?

Было предложено разводить такую среду какой-нибудь простерилизованной жидкостью (водой, солевым раствором) до тех пор, пока в одной её капле не будет содержаться только одна клетка микроба. Такой каплей заражали стерильную питательную среду.

Но этот сложный и трудоёмкий метод не давал всё же абсолютной гарантии чистоты культуры: можно ли быть уверенным, что в капельке действительно находится только одна микробная клетка? Удостовериться в этом можно было только при помощи микроскопа. Выделение чистых культур из одной клетки производится под микроскопическим контролем: на поверхность тоненького стерильного стёклышка (так называемого покровного стекла) стерильным чертёжным пёрышком наносят ряд крошечных капелек из разведённой питательной жидкости, содержащей микробов. Покровное стекло с каплями накладывается на предметное стекло с углублением, края обмазываются вазелином, и получается невысыхающая влажная камера. Микробиолог тщательно просматривает под микроскопом содержимое капелек и отмечает те капли, где находится только по одной клетке. Затем микроскоп вместе с препаратом ставится в особый шкаф — термостат — прибор, сохраняющий постоянную температуру, в котором культивируются разводки микробов. При благоприятной температуре микробная клетка начинает делиться, и скоро в капельке разрастается целое скопление микробов — потомков одной клетки. При помощи простерилизованной над пламенем горелки платиновой иголочки или петельки, вставленной в петледержатель, такой капелькой можно заразить колбу или пробирку с питательной средой и получить в нужном количестве чистую культуру из одной клетки. В последние годы сконструированы особые приборы, так называемые микроманипуляторы, которые дают возможность под контролем микроскопа подхватить тончайшей стеклянной петелькой или пипеткой одну микробную клетку и перенести её в свежую питательную среду. Советский ученый проф. Б. В. Перфильев недавно разработал способ изготовления тончайших стеклянных капилляров. Его прибор, так называемый микроселектор, позволяет под контролем глаза выловить и затянуть в капилляр одну клеточку мельчайшей бактерии, затем автоматически стерильно отломить содержащий эту клетку кусочек капилляра и заразить им свежую питательную среду.

Но обычно в своей текущей работе микробиолог применяет более простой способ получения чистых культур — выделение их на плотных питательных средах. Оставьте в комнате на 10–15 минут тоненький ломтик картофеля и потом, предохранив его от высыхания, поместите на сутки в термостат. Вы увидите, что на поверхности ломтя появились мелкие округлые образования грязно-белого, жёлтого и красноватого цвета. Это так называемые колонии микробов, осевших из воздуха на поверхность картофеля и размножившихся там до видимых невооружённым глазом скоплений (колоний). Каждая колония — это миллиардное потомство одной особи, приставшей к влажной поверхности картофеля. Р. Кох первый обратил внимание на то, что таким путём можно легко выделить чистую культуру микроба, и предложил свой метод «пластинчатых разводок», в которых развивались отдельные колонии, происходящие из одиночных клеток. Кроме ломтей картофеля и моркови, Кох предложил применять в качестве плотной питательной среды питательный мясной бульон, к которому прибавлено 10 процентов желатины. Получается плотный студень, на котором прекрасно развиваются отдельные колонии (рис. 21). Но так как желатина разжижается при 22–26° и не может выдержать температуры термостата, при которой обычно выращивают болезнетворных микробов, то она была заменена агар-агаром, который также придает плотность питательной среде, но плавится только при 100°, а застывает при 40–45°.

Рис. 21. Колонии различных бактерий на плотной питательной среде