Разъяренный В. Кочубей, сговорившись со свояком, полтавским полковником Иваном Искрой, решил прибегнуть к испытанному способу выяснения отношений — доносу царю. Донос состоял из 33 пунктов, но при всей кажущейся обстоятельности ни один из них не содержал информации, доказывающей неверность И. Мазепы Москве. Из доноса следовало и без того понятное: в ставке пожилого гетмана ведутся разговоры о ходе Северной войны и взвешиваются шансы сторон на победу. При этом личный мотив доноса был очевиден.
Петр доносу не поверил и начал следствие против самих доносчиков. И. Искра под пытками признался, что на это дело его подбил В. Кочубей, а тот, не стерпев мук, сказал, что затеял все, желая отомстить, и показал царю связку писем И. Мазепы к его дочери. Тогда царь, сам не отягощенный предрассудками в амурных делах, велел обоих доносчиков передать гетману для казни по решению войскового суда. 14 июля Кочубей и Искра были публично казнены в присутствии И. Мазепы и его войска в военном лагере под Белой Церковью.
Но, как потом оказалось, И. Мазепа тайно, через своих старых знакомых в Варшаве, поддерживал связи с окружением С. Лещинского, а затем и с Карлом XII. Конспирация и интриги были настолько тонкими и умелыми, что доподлинно эту сторону деятельности гетмана восстановить невозможно. Несомненно, однако, что при неопределенности исхода Северной войны И. Мазепа, как всякий опытный политик на его месте, хотел подстраховаться и получить дивиденды при любом повороте событий. Он действовал не в интересах Петра или Карла, а в своих собственных, и потому, когда шведский король, выведя из борьбы Данию и Саксонию и утвердившись в Польше, все силы сосредоточил против России, И. Мазепа счел его шансы на победу более вероятными, чем у Петра. Переход на сторону предполагавшегося победителя позволял рассчитывать на создание (в стратегическом союзе со Швецией) независимой Украины по обе стороны Днепра под властью престарелого гетмана.
Видимо, никогда не будет точно установлено, избрал ли Карл XII свой маршрут в кампании 1708–1709 годов, заведомо полагаясь на поддержку со стороны гетмана, или же И. Мазепа окончательно решил перейти на его сторону ввиду начавшегося в середине сентября 1708 года, движения шведской армии в Украину. Вдогонку Карлу XII из Риги шел оснащенный артиллерией и большим количеством боеприпасов корпус генерала Левенгаупта, но в сражении при Лесной 28 сентября он был перехвачен и разбит.
Стремясь побыстрее воспользоваться плодами победы при Лесной и еще до конца 1708 года разбить основные силы шведов, Петр I приказал И. Мазепе с украинскими полками идти на соединение с русской армией к Стародубу. Однако тот медлил, ссылаясь на свою болезнь и другие осложняющие обстоятельства. Ему нужно было принять окончательное решение — с кем быть: с Петром или с Карлом, а исход войны опять становился неопределенным. Сохранение верности Петру гарантировало победу России и удержание Украины в ее составе, причем царь не скрывал намерения ввести тут новую, более отвечавшую принципам централизованного государства, форму управления. Этого опасались и запорожские казаки, в частности, близкий И. Мазепе атаман К. Гордиенко. К тому же, в любую минуту Петр мог узнать о тайном соглашении между гетманом и шведским королем. Переход Украины на сторону Швеции, казалось бы, перевешивал чашу весов победы на сторону Карла, а значит, и создания И. Мазепой самостоятельного украинского государства.
Царские войска приближались, приказы присоединиться к российской армии следовали один за другим. Тогда, после проходивших в глубокой тайне совещаний с самыми близкими людьми, среди которых особенно выделялся молодой, одаренный Филипп Орлик, Иван Мазепа, наконец, принял решение. 24 октября 1708 года с пятитысячным отрядом и вовлеченными в его план лицами из круга казацкой старшины он переправился через Десну и открыто пошел на соединение с Карлом, полагая, что на его призыв вступить в союз со шведами откликнется вся Украина. Официально переход на сторону Карла в воззвании к народу мотивировался невыносимостью царского гнета и попранием исконных вольностей и прав украинского казачества, что бесспорно соответствовало истине. Однако находившийся с войсками возле украинских границ Александр Меншиков немедленно предпринял упреждающие действия. Он быстро перекрыл переправы через Десну, чтобы не дать вслед за гетманом перейти на сторону Карла украинским полкам, и 28 октября издал манифест к украинскому народу. В нем он клеймил И. Мазепу как изменника, который сошелся со шведами для того, «чтобы украинскую землю закрепостить под польское господство и церкви Божии и монастыри отдать в унию». Это было ложью, но, тем не менее, цели достигало: народ готов был в это поверить.
Поступок И. Мазепы вызвал недоумение и растерянность не только простых людей, но и основной части казацкой старшины. Подобного поворота никто не ожидал. В то же время, А. Меншиков 2 ноября захватил гетманскую резиденцию Батурин, перебил население города (около 20 тысяч человек) и завладел запасами вооружения и продовольствия.
Через четыре дня в Глухове, в присутствии царских представителей состоялась казацкая рада с участием четырех полковников: стародубского — Скоропадского, черниговского — Полуботка, переяславского — Томары и нежинского — Жураховского. И. Мазепа был объявлен изменником и низложен, а вместо него гетманом избран стародубский полковник И. Скоропадский, который, не веря в успех предпринятого И. Мазепой шага, не откликнулся на присланный ему призыв перейти на сторону шведов и сохранил верность Петру.
12 ноября, выполняя царский приказ, украинское духовенство предало Ивана Мазепу анафеме. Отлучение от церкви грозило всем, кто последует за ним и перейдет на сторону шведов. Вскоре к Петру присоединились еще два полковника, ранее поддержавших И. Мазепу: миргородский Апостол и компанийский Галаган. Посмертно были реабилитированы Кочубей и Искра, их семьям возвратили владения и дали новые привилегии. Из Сибири возвратился С. Палий.
Вскоре, видя, что силы Карла невелики и помощи ему ждать неоткуда, тогда как в армию Петра прибывают все новые пополнения, от И. Мазепы отступились и те, кто поначалу поддержал его: генеральный судья Чуйкевич, генеральный есаул Максимович, лубенский полковник Зеленский и другие. Простой народ сохранял лояльность к Петру, опасаясь в случае неповиновения зверских расправ, подобных тем, что обрушились на жителей Батурина и его окрестностей.
Между тем, боевые действия продолжались. К концу 1708 года шведы, перейдя Десну, заняли район Прилуки — Гадяч — Ромны; российские войска расположились возле Сум, Богодухова и Ахтырки, прикрывая дорогу на Харьков. В Киеве также оставались верные Петру войска. С наступлением весны Карл придвинул свою армию к Полтаве, гарнизон которой оказал сопротивление. К. Гордиенко привел на помощь шведам часть запорожцев, а в это время российские войска совместно с казаками Галагана атаковали и уничтожили Сечь.
Положение Карла и Мазепы становилось все более тяжелым. 27 июня (8 июля) произошло решающее сражение под Полтавой, в ходе которого лично от И. Мазепы уже ничего не зависело.
Никольский собор в Киеве. Построен под покровительством И. Мазепы. 1690–1696 гг.
Вместе с Карлом ему пришлось бежать к Днепру и, переправившись у Переволочной, искать спасения во владениях Турции. На татарских телегах хранившие верность гетману запорожцы перевезли их через степи к Южному Бугу, где беглецов настиг посланный вдогонку отряд генерала Волконского, но им все же удалось добраться до Очакова.
Петр решительно требовал от султана выдачи беглецов, однако его усилия оказались тщетными. В отличие от Карла, оказавшегося в Турции ни с чем (кроме, разумеется, королевского титула и славы великого полководца), И. Мазепа и здесь располагал огромными по тем временам суммами. Шведскому королю он вскоре одолжил 240 тыс. талеров, а после смерти при нем нашли еще 160 тыс. талеров, много серебряной посуды и драгоценностей.