Посттрансляционная ковалентная модификация происходит в боковых группах аминокислотных остатков нескольких белков [357]. Хромосомные белки — как гистоны, так и НГБ — синтезируются в цитоплазме и затем переходят в ядро, где они связываются с ДНК. Эти белки, особенно гистоны, подвергаются разнообразным посттрансляционным ковалентным модификациям: фосфорилированию, ацетилированию, метилированию и ADPрибозилированию. Ацетилирование NH₂-концевого серинового остатка гистонов Н1, H2A и Н4 происходит во время трансляции и представляет собой стабильную модификацию [229]. Ацетилирование внутренних лизиновых остатков гистонов Н3 и Н4 и фосфорилирование внутренних сериновых остатков происходит в цитоплазме. Затем эти гистоны переходят в ядра и связываются с ДНК [308]. Ацетилирование внутренних лизинов обратимо. Кроме того, обратимая модификация лизиновых остатков происходит уже после связывания гистонов с ДНК. Путем ковалентных модификаций четырех типов изменяются ионный состав гистонов и их стерические свойства, а следовательно, и взаимодействие с ДНК (рис. 2.4).

Рис. 2.4. Структура хроматина с указанием центров связывания гистонов и НГБ с ДНК. Представлены ковалентные модификации гистонов, в результате которых изменяется их связывание с ДНК

При таких модификациях, как фосфорилирование и ADPрибозилирование, число отрицательных зарядов на гистонах увеличивается, и это может привести к их отделению от ДНК, в результате чего становится возможной ее транскрипция или репликация. При ацетилировании общий положительный заряд на гистонах уменьшается. Это также может приводить к их отделению от ДНК. Вместе с тем при метилировании положительный заряд на молекулах гистонов может увеличиваться, что приводит к более сильному связыванию их с ДНК и, как следствие, к подавлению активности генов. Специфические аминокислоты подвержены специфическим модификациям. Определенные модификации преимущественно происходят в определенных гистонах и к тому же на специфических фазах клеточного цикла и роста клетки. Таким образом, не исключено, что модификации боковых групп хромосомных белков являются механизмом тонкой регуляции экспрессии генов. В табл. 2.3 приведены некоторые характеристики этих модификаций.

Таблица 2.3. Параметры ковалентных модификаций цепей гистонов

Фосфорилирование

Фосфорилирование хромосомных белков представляет собой энергозависимую постсинтетическую модификацию. Оно происходит как в цитоплазме, так и в ядре [273, 276, 308]. Орд и Стокен [275] продемонстрировали включение в гистоны ³²P in vivo. Позднее было показано, что гистон Н1 фосфорилируется в большей степени, чем другие гистоны [23]. Главными центрами фосфорилирования с помощью специфических с АМР-зависимых протеинкиназ являются боковые группы сериновых и треониновых остатков гистонов и НГБ. Лизиновые, гистидиновые и аргининовые остатки фосфорилируются в малой степени. Киназы присутствуют во фракции НГБ хроматина. В фосфорилировании специфических центров, по-видимому, участвуют специфические гистоновые киназы. Из хроматина тимуса быка удалось выделить АМР-зависимую киназу, которая фосфорилирует единственный центр в гистоне Н3 [321]. Дефосфорилирование этих остатков производится фосфатазами, которые также присутствуют во фракции НГБ. Надежно установлено, что фосфорилирование и дефосфорилирование ферментов являются одним из основных механизмов регулирования их активности, поскольку эти модификации, вызывая конформационные изменения, переводят ферменты из активного состояния в неактивное, и наоборот [137]. При подобных модификациях в молекулах хромосомных белков происходят структурные изменения, которые могут приводить к функциональным изменениям хроматина. Реакция фосфорилирования — дефосфорилирования гистона показана ниже:

В молекулах хромосомных белков обнаружены два типа присоединения фосфатных групп [79]. Один из них, включающий связь Р-О, характерен для сериновых и треониновых остатков, причем эта связь устойчива по отношению к кислоте. Второй тип включает связь P-N, которая образуется в лизиновых, гистидиновых и аргининовых остатках. Эта связь неустойчива в кислых средах.

Фосфорилирование гистонов

Процесс фосфорилирования — дефосфорилирования внутренних остатков хромосомных белков совершается с большой скоростью. Быстрое фосфорилирование наблюдается не только в делящихся, но и в неделящихся клетках после их стимуляции различными эффекторами. В основном фосфорилированию подвержен гистон Н1, т. е. фосфорилирование гистонов, по-видимому, не влияет на транскрипционную активность хроматина.

Центры фосфорилирования гистона Н1 различны на разных стадиях клеточного цикла. Ser-37 фосфорилируется в фазе G₁, Ser-114 в фазах S и G₂, Ser-180 — в фазе М [206]. По-видимому, это объясняется множественностью Н1-киназ, каждая из которых специфична. Было показано, что быстрорастущие клетки содержат специфичную гистон-киназу, которая катализирует фосфорилирование треониновых остатков, но не Ser-37 и Ser-105 [216]. При фосфорилировании одного из остатков Ser-37 и Ser-105 или обоих степень связывания гистона Н1 с ДНК значительно уменьшается [299]. Такие различия в свойствах разных центров фосфорилирования могут объяснять функциональную роль гистона Н1 в конденсации хроматина. При фосфорилировании различных центров хроматин деконденсируется различным образом, благодаря чему открываются разные участки ДНК.

Показано, что фосфорилирование гистонов связано с изменениями в структуре хроматина особенно во время митоза [140, 143, 144]. Высокая скорость фосфорилирования наблюдается во время митоза клеток яичника китайского хомячка. Такие же модификации наблюдаются в клетках HeLa [209, 210]. Центры фосфорилирования гистона Н1 при митозе (Him) отличаются от центров во время интерфазы (НИ) [25, 162., 209]. Было выдвинуто предположение, что фосфорилирование гистона Н1 необходимо для конденсации интерфазного хроматина в хромосомы. Это совпадает с данными, согласно которым трижды фосфорилированный гистон Н1 связывается с ДНК сильнее, чем дефосфорилированный [196]. У слизистого гриба Prysarum polycephalum фосфорилирование гистона Н1 увеличивается в середине фазы G₂ и резко нарастает вплоть до профазы [253]. Дефосфорилирование происходит в последней стадии митоза.

Фосфорилирование различных центров наблюдается также у гистона Н3, но оно не обнаружено у гистонов Н2А, Н2В и Н4. В детальных исследованиях фосфорилирования гистонов Н1 и Н3 из яичника китайского хомячка в процессе митоза было показано, что у большинства клеток эукариот 2–4 центра в гистоне Н1 фосфорилируются в фазе S и дополнительные центры во время митоза (М) [25]. Центры фосфорилирования в фазах S и М, по-видимому, независимы. Более того, эти центры отличаются от тех, которые участвуют в ответе на действие гормона [216]. На ранних стадиях препрофазы, когда начинается агрегация хроматина, гистон Н1 имеет 1–3 фосфатные группы на молекулу, а гистон Н3 не фосфорилируется [95, 140]. Во время промета- и анафазы, когда хроматин агрегирует, все молекулы гистона Н1, а также Н3 суперфосфорилируются и имеют 3–6 фосфатных групп на молекулу. Это может быть обусловлено 6-10-кратным увеличением в митотических клетках содержания специфической АТР-гистон-фосфотрансферазы [209, 210]. Благодаря суперфосфорилированию фибриллы хроматина способны скручиваться в сверхспирали. В телофазе, когда хроматин дезагрегирует, оба гистона, Н1 и Н3, дефосфорилируются. Когда клетки вступают в фазу G₁, гистон Н1 полностью дефосфорилируется. Таким образом, суперфосфорилирование гистона Н1m и фосфорилирование гистона Н3 являются митотическими событиями, которые происходят только тогда, когда хромосомы полностью конденсированы. Следовательно, для конденсации хроматина во время митоза необходима высокая степень фосфорилирования гистонов Н1 и Н3, тогда как дефосфорилирование ограничивает этот процесс в интерфазе. Удивляет, однако, тот факт, что при высокой степени фосфорилирования, когда, казалось бы, должна была происходить диссоциация комплекса гистонов Н1 и Н3 с ДНК из-за увеличения отрицательных зарядов на них, наблюдается увеличение конденсации. Для того чтобы выяснить фундаментальный механизм, с помощью которого происходят конденсация и деконденсация хромосом, необходимы дальнейшие исследования. В печени крысы в период развития фосфорилирование гистона Н1 значительно, но оно пренебрежимо мало в печени взрослых животных [22]. Однако фосфорилирование усиливается, когда клетки печени делятся после частичной гепатэктомии [24]. Показано, что в этих условиях отношение числа связей P-O к P-N в печени меняется [79]. P-N-связи обнаруживаются главным образом в гистонах Н1 и Н4. Содержание Hl-киназы на протяжении клеточного цикла не меняется, но количество Н4-киназы увеличивается во время синтеза ДНК. Гистон Н4 также максимально фосфорилируется в фазе S, примем центрами атаки являются гистидиновые остатки. Таким образом, в результате фосфорилирования гистон Н4 может отделяться от ДНК, что способствует ее репликации. Отсюда можно, по-видимому, заключить, что фосфорилирование гистонов необходимо для репликации ДНК, за которой следует деление клетки [26, 161]. Показано, что транскрипция изолированных нуклеосом печени крысы после фосфорилирования усиливается [278]. Фосфорилированный и нефосфорилированный гистоны Н1 отличаются друг от друга по способности подавлять матричную активность хроматина [365]. С помощью метода кругового дихроизма было обнаружено, что фосфорилированные гистоны обладают измененной конформацией [6]. Этим может объясняться тот факт, что модифицированные гистоны вызывают дерепрессию хроматина.