Приведенные выше заключения подтверждаются следующими фактами. Транскрипционно неактивный гетерохроматин инфузорий имеет низкую степень ацетилирования, тогда как эухроматин транскрипционно активен и сильно ацетилирован [232]. Транскрипционно активные макроядра Tetrahymena pyriformis содержат ацетилированные гистоны, тогда как в репрессированных микроядрах их нет [136]. Активные материнские хромосомы червеца содержат значительно больше ацетильных групп, чем неактивные отцовские хромосомы [34]. В исследованиях, выполненных на клетках Drosophila в культуре [227], показано, что ¹⁴С-ацетат включается главным образом в гистоны Н3, Н4 и Н2В, а ³²Р-фосфат — в гистоны Н1, Н3 и Н4. Самое высокое содержание как ¹⁴С-ацетата, так и ³²Р наблюдается в гистоне Н3. Когда матрично активные и матрично неактивные области хроматина разделяли после его переваривания ДНКазой II, было обнаружено, что первые содержат большее количество обеих меток (¹⁴С и ³²Р). Эти данные подтверждают предположение, что различия между транскрибируемыми и нетранскрибируемыми областями хроматина отчасти объясняются специфическими модификациями гистонов в определенных локусах.

Степень ацетилирования гистонов из клеток семенника форели изучали путем инкубирования их с ¹⁴С-ацетатом [96]. Гистоны Н2А, Н2В и Н3 ацетилируются в одном положении, в то время как гистон Н4 — в одном, двух, трех и четырех положениях. Когда нуклеосомы, полученные после ацетилирования, обрабатывали трипсином, при этом удаляли NH₂-концевые области четырех гистонов, содержащие лизиновые остатки и связанные с ДНК. Эти лизиновые остатки как раз и были ацетилированы. Если нуклеосомы затем расщепляли нуклеазой, то освобождались фрагменты ДНК, обычно при наличии NH₂-концевых областей устойчивые к нуклеазе [368]. Ацетилирование приводит к увеличению скорости расщепления хроматина ДНКазой I [268, 362]. Хроматин, содержащий высокоацетилированные гистоны, легче расщепляется ДНКазой I, но не микрококковой нуклеазой [244]. Когда хроматин из семенника форели гидролизовали ДНКазой II, получали транскрипционно активную фракцию, содержащую высокоацетилированный гистон Н4 [97]. Гистоны Н3 и Н4 клеток HeLa сильно ацетилируются при выращивании в бутирате. Нуклеосомная ДНК таких клеток гидролизуется ДНКазой I в 5-10 раз быстрее. При этом ДНК специфически расщепляется в сайте, где в нормальных условиях разрыва не происходит [324]. Показано также [268, 315, 316], что ДНКаза I предпочтительно расщепляет ДНК в тех областях хроматина, которые сильно ацетилированы. По-видимому, нуклеосомы в этих областях после ацетилирования подвергаются конформационным изменениям. Поскольку такие изменения необходимы для того, чтобы РНК- и ДНК-полимеразы могли использовать ДНК в качестве матрицы, не исключено, что ацетилирование представляет собой один из. способов, с помощью которого гистоны частично отделяются от ДНК, благодаря чему последняя становится доступной для ферментов. Таким образом, ацетилирование важно как для функционирования хроматина, так и для его структуры и конформации. Высказано предположение, что гистон Н4 связывается с ДНК по механизму, на первых стадиях которого происходит ацетилирование [236]. Затем может произойти деацетилирование, приводящее к электростатическим взаимодействиям, в результате которых закрепляется конформация. В сперматиде морского ежа, не синтезирующей РНК, гистон Н4 полностью деацетилирован, тогда как в эмбрионе, где наблюдается высокая активность генов, он ацетилирован [53]. Таким образом, между ацетилированием гистона Н4 и активностью хроматина наблюдается прямая корреляция.

Изучению роли ацетилирования гистонов в функционировании хроматина способствовало обнаружение того факта, что в присутствии бутирата эта модификация усиливается и гистоны Н3 и Н4 специфически гиперацетилируются [68, 302, 315], так как бутират ингибирует гистон-деацетилазу. Бутират ингибирует предпочтительно эндогенную деацетилазу гистонов Н3 и Н4 [287], и при этом он не влияет на скорость ацетилирования [41, 68, 300]. По-видимому, гистон-деацетилаза может играть важную роль в метаболическом контроле ацетилирования. При гиперацетилировании гистонов связанная с ними ДНК в клетках HeLa становится более доступной для ДНКазы I, но не для стафилококковой нуклеазы. ДНКаза I способствует также удалению из комплекса гистонов Н3 и Н4 [359]. Одновременно подавляется синтез ДНК [146]. Можно предположить, что ацетилирование гистонов специфически необходимо для транскрипции и не нужно для репликации. В отличие от фосфорилирования, которое характерно для гистона Н1 и только делящихся клеток, ацеталирование протекает главным образом в гистонах Н3 и Н4 и в делящихся, а также неделящихся клетках, которые метаболически активны. Это подтверждает предположение, согласно которому ацетилирование нуклеосомных гистонов играет важную роль в транскрипции. Об ацетилировании НГБ известно очень мало; в одной из работ сообщается, что ацетилируются белки HMG из ядер тимуса теленка и эритроцитов утки [333].

Метилирование

Метилирование гистонов является постсинтетической необратимой модификацией, которая катализируется гистон-метилтрансферазой III, присутствующей во фракции НГБ хроматина. Эта модификация была впервые обнаружена Олфри и сотрудниками [13]. Гистон-метилтрансфераза III катализирует переход СН₃-группы из S-аденозилметионина в ε-NH₂-группу лизинового остатка, как показано ниже:

Эта модификация гистонов происходит после их связывания с ДНК. Метальные группы гистонов в отличие от фосфорильных и ацетильных групп не вступают в дальнейшие реакции [62, 63]. Вследствие этого метилирование является стабильным процессом. Цитоплазматический фермент — метилаза I метилирует аргинин прежде, чем гистон проникает в ядро [363]. НГБ метилируются особым ферментом. С атомом ε-N-лизинового остатка могут быть связаны одна, две или три метальные группы, которые последовательно вводятся одним и тем же ферментом. Поэтому метиллизиновые остатки могут представлять собой моно-, ди- или триметиллизин. В основном метилируются гистоны Н3 и Н4. В гистоне Н3 соотношение моно-, ди- и триметиллизинов составляет 1,8:1,0:0,45. В гистоне Н4 отношение моно- к диметиллизину равно 0,7:1,0. Таким образом, гистон Н3 метилирован в большей степени, чем гистон Н4. Очищенные гистоны в противоположность гистонам, связанным с хроматином, являются неподходящими субстратами для метилирования. Метилированные гистоны Н3 и Н4 после выделения могут метилироваться и дальше по центрам, отличным от тех, по которым идет реакция для гистонов, связанных с хроматином. Очевидно, эти дополнительные центры недоступны для метилирования из-за специфической конформации в хроматине. Метиллизины расположены вблизи ацетилированных лизинов.

Метилирование гистонов Н3 и Н4 происходит только в NH₂-концевой области. Гистон Н3 из тимуса теленка метилируется в Lys-9 и Lys-27, а гистон Н4 — в Lys-20. Оба лизина в гистоне Н3 могут быть моно-, ди- и триметилированы, но в гистоне Н4 триметиллизин не образуется [100, 107, 164]. Гистон Н3 имеет дополнительный центр метилирования — Lys-4. Центры метилирования гистонов Н3 и Н4 так же, как их последовательности аминокислот, чрезвычайно консервативны. K_м и V_max для метилирования гистонов Н3 и Н4 различны. S-аденозилгомоцистеин — продукт реакции, которую катализирует метилтрансфераза III, — является конкурентным ингибитором субстрата [109, 363].

Метилирование гистонов клеток HeLa происходит главным образом в S-фазе [219]. В культуре ткани метилирование протекает в течение всего клеточного цикла, но максимальная скорость наблюдается между S- и G₂-фазами перед началом митоза [320, 350, 352]. Возможно, метилирование необходимо для подготовки хроматина к митозу. После частичной гепатэктомии метилирование гистонов происходит во время важного для клетки периода после S-фазы [218]. Степень метилирования гистонов Н3 и Н4, по-видимому, одна и та же во всех органах, но изменяется с возрастом [107]. У десятидневных крыс молярное соотношение моно-, ди- и триметиллизинов в гистоне Н3 составляет 0,55:1,0:0,35. Молярное соотношение моно- и диметиллизинов в гистоне Н4 в том же возрасте равно 0,1:0,9. С увеличением возраста наблюдается постепенный сдвиг в сторону более метилированных форм. Гистоны Н3 и Н4 в мозгу взрослых крыс не обновляются, так же как не обновляются и их метальные группы независимо от полипептидных цепей [108]. Хонда и др. [165] показали, что метилирование гистонов необратимо и в других тканях. Когда молодым крысам вводили меченый лизин и метионин, значительные количества каждой метки обнаруживали в гистонах мозга. Однако у взрослых особей находили лишь следы этих меток. Если ядра из клеток мозга взрослых крыс инкубировать с S-аденозилметионином, то ни одна метильная группа не включается в гистоны Н3 и Н4. Эти результаты свидетельствуют о том, что метилирование гистонов заканчивается перед наступлением зрелости. Метилированные гистоны могут иметь несколько функций. 1) При метилировании лизиновых остатков, в частности при образовании трифениллизинов, повышается pK ε-NH₂-группы лизина и увеличивается основность гистонов. Это может усиливать связь гистонов с ДНК. 2) Метилирование гистонов Н3 и Н4 может играть важную роль в структуре нуклеосом. 3) Метилированные гистоны могут необратимо "запирать" ДНК и препятствовать репликации. Возможно, этим объясняется переход клеток в постмитотическое состояние. 4) Метилированные гистоны могут ингибировать транскрипцию. Для оценки роли метилирования гистонов в структуре и функциях хроматина необходимы дальнейшие исследования.