Фибрилла коллагена состоит из нескольких мономеров. Мономеры объединяются двумя способами. Они располагаются конец-в-конец, причем NH2-конец одной цепи обращен к COOH-концу другой. Цепи лежат рядом, но сдвинуты друг относительно друга на 234 остатка, что соответствует 66,7 нм. Этот сдвиг, или период, обозначают "D". Мономеры, расположенные рядом, удерживаются ковалентными поперечными связями, образованными модифицированными лизиновыми остатками. Упомянутый выше сдвиг таков, что Lys9 α-цепи одного мономера располагается против Lys934 α-цепи соседнего мономера; между этими лизинами образуется ковалентная поперечная сшивка, благодаря которой мономеры удерживаются рядом.
Между мономерами, расположенными конец-в-конец, имеется зазор ~30 нм (~0,4D). Поэтому мономер одной линейной последовательности налагается на соседней мономер со сдвигом ~0,4 D. Эти зазоры и наложения чередуются, что выявляется на электронных микрофотографиях фибрилл коллагена в виде светлых (зазор) и темных (наложение) линий. Этим и объясняется бороздчатый вид фибрилл на электронных микрофотографиях (рис. 4.8).
Рис. 4.8. Электронная микрофотография микрофибриллы коллагена, окрашенной фосфорновольфрамовой кислотой [32]. Видна бороздчатость микрофибриллы
Каждый мономер коллагена имеет длину 300 нм и диаметр 1,5 нм. Пять мономеров со сдвигом друг относительно друга D образуют микрофибриллу диаметром ~4 нм. Микрофибриллы закручены в спираль с шагом 70 нм. Несколько микрофибрилл образуют фибриллу, диаметр которой зависит от числа микро-фибрилл [37, 47, 58, 82, 94].
В тканях встречается коллаген четырех основных типов, характеризующихся разной структурой объединения α-цепей в тройные спирали (табл. 4.1). Коллагену, подобно некоторым ферментам, которые существуют в виде изоферментов, присущ молекулярный полиморфизм. Существует 5 типов α-цепей, и, следовательно, возможно образование 35 разных тройных спиралей. Почему образуются только четыре типа — неизвестно.
Таблица 4.1. Типы, строение, локализация и характеристики коллагена
Жесткие ткани — кости, сухожилия, кожа — содержат коллаген типа I, молекула которого состоит из двух цепей α1(I) и одной α2. Эти мономеры образуют плотноупакованные шероховатые фибриллы, и на их электронных микрофотографиях видны обычные поперечные полосы (рис. 4.8). Это наиболее распространенный тип коллагена у позвоночных. Пластичные ткани — кожа зародышей, гладкие мышцы (матки и пищеварительного тракта), кровеносные сосуды, легкие, связки и хрусталик — кроме коллагена типа I содержат коллаген типа III. В этих тканях коллаген состоит из трех цепей α1(III), а фибриллы расположены хаотически. Соотношение коллагена типа I и типа III в них равно (2–3):1. Коллаген типа III синтезируется на ранних стадиях заживления ран, но по мере созревания рубца его синтез сокращается и постепенно увеличивается синтез коллагена типа I.
В каждой ткани преобладает коллаген какого-либо одного типа. Пульпозное ядро межпозвоночных дисков человека содержит только коллаген типа II, а окружающее ядро фиброзное кольцо — коллаген типа I и II [23]. При некоторых заболеваниях уменьшается доля коллагена типа III [71], Кожа зародыша содержит больше коллагена типа III, чем типа I, а у взрослых соотношение меняется на обратное [19].
Внутриклеточные процессы
В опытах по гибридизации соматических клеток с использованием фибробластов человека и мыши установлено, что гены, ответственные за синтез коллагена типа I и III человека, расположены в разных хромосомах [61]. α-Цепь каждого типа кодируется отдельной моноцистронной мРНК. Следовательно, разные α-цепи кодируются разными генами [18]. Изучение гибридизации РНК-ДНК с использованием кДНК, полученной с помощью мРНК для про-α-цепей, показало, что для α-цепи каждого типа есть только один ген [26]. мРНК для про-α-цепи содержит ~4500 нуклеотидов и имеет на 3′-конце полиадениловый "хвост" длиной ~150 нуклеотидов [35]. Предшественник коллагена — проколлаген (про-α) транслируется с мРНК на полирибосоме в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме примерно за 4,8 мин. Про-α1 и про-α2 синтезируются на отдельных полирибосомах.
Про-α состоит из ~1500 остатков и имеет мол. массу ~150000. Он имеет NH2- и COOH-концевые участки, NH2-пропептид и COOH-пропептид, к которым присоединены короткие телопептиды в 15–25 остатков (рис. 4.9). Структура этих участков отличается от структуры, свойственной коллагену, и характеризуется отсутствием спиральной конформации.
Рис. 4.9. Биосинтез коллагена. Про-α-цепи синтезируются на полирибосомах. Эти цепи имеют концевые неспиральные участки, в которых нет типичной для коллагена последовательности Gly-X-Y. Про-α-цепи объединяются в клетках в тройную спираль проколлагена за счет образования водородных связей, а затем выделяются в межклеточный матрикс. Специфические пептидазы удаляют с обоих концов проколлагена пропептиды, в результате чего образуется мономер коллагена. Лизиновые остатки модифицируются ферментами и образуют ковалентные связи между цепями. Мономеры коллагена объединяются в микрофибриллы. Мономеры удерживаются друг около друга ковалентными поперечными сшивками между модифицированными лизиновыми остатками. АК — аминокислота
Возможно, NH2-пропептид сигнализирует о секреции, как это имеет место в случае других секреторных белков. Некоторые пролиновые и лизинговые остатки в ходе трансляции гидроксилируются. Гидроксилирование происходит даже по окончании трансляции. В NH2- и COOH-пропептидных областях коллагена всех типов присутствуют цистеиновые остатки [34]. Они образуют S — S-связи между цепями и способствуют выстраиванию α-цепей при образовании тройной спирали [60]. Из клетки выходят только правильно построенные тройные спирали. Следовательно, образование S — S-ковалентных связей между цепями помогает не только выстраиванию, но и секреции мономеров [68]. Некоторые гидроксилированные Lys перед формированием тройной спирали гликозилируются [12]. Степень гидроксилирования Pro и Lys и гликозилирования оксилизина (Hyl) соответствует ряду: тип III>тип II>тип I. Время, которое требуется на эти модификации, также подчиняется этому порядку.
Гидроксилирование пролина
Гидроксилирование Pro стабилизирует тройную спираль. Эту реакцию катализирует пролилгидроксилаза [40, 60] — фермент, связанный с шероховатым эндоплазматическим ретикулумом. Фермент, выделенный из куриных эмбрионов, имеет мол. массу 230 000. Он представляет собой тетрамер, состоящий из мономерных субъединиц двух типов — с мол. массой 60000 и 64000 [60]. Мономер неактивен. Молекула фермента имеет сильно выраженные кислотные свойства, ее pI=4,4. Пролингидроксилаза катализирует превращения только пептидилпролина, по отношению к свободному пролину она неактивна. Этот фермент является оксигеназой со смешанными функциями. Для его активирования требуются молекулярный кислород, Fe2+, α-кетоглутаровая и аскорбиновая кислоты. Одновременно с гидроксилированием пролина α-кетоглутаровая кислота окислительно декарбоксилируется с образованием сукцината. При этом выделяется CO2, количество которого измеряют при определении активности фермента. Кислород расходуется в реакции прямого замещения в положении С-4 пролинового остатка. Есть сообщение [52], что аскорбиновая кислота нужна не для самой реакции гидроксилирования, а для последующего восстановления железа в ферменте. Субстраты связываются с ферментом в следующем порядке: Fe2+, α-кетоглутаровая кислота, кислород, полипептид. Гидроксилирование происходит только после того, как все четыре субстрата связались с ферментом. Продукты удаляются в следующем порядке: гидроксилированный пептид, CO2, сукцинат. Аскорбат не расходуется стехиометрически. Он ассоциирует с ферментом либо до связывания железа, либо после удаления одного или двух продуктов [86]. In vitro несколько пролиновых остатков гидроксилируются в отсутствие аскорбата. По-видимому, аскорбат не является необходимым для гидроксилирования [64]. Он требуется для регенерации железа в восстановленной форме. При недостатке аскорбиновой кислоты цепи коллагена гидроксилируются не полностью [8].
