Кроме снижения пролиферативной активности клеток в фазе III (рис. 8.2) изменяются некоторые метаболические параметры (табл. 8.1). Содержание одних ферментов снижается, других — повышается или остается прежним. Эти изменения сходны с теми, которые наблюдаются в различных органах животного in vivo при старении (гл. 3). Момент снижения пролиферативной активности легко регистрируется и принимается обычно за начальную точку фазы III, правда, некоторые изменения метаболических параметров возникают раньше уменьшения скорости деления. Несомненно, что репликация зависит от интенсивности метаболизма, снижение которой не может не отразиться на способности клеток к пролиферации. Холлидей иТаррент [28], а также Линн и др. [35] сообщили, что на поздних этапах фазы III легочные фибробласты человека MRC-5 содержат измененную ДНК-полимеразу, имеющую аминокислотные замены. По-видимому, именно этим объясняется уменьшение пролиферативной активности клеток. Оргел [39] предположил, что в ДНК-полимеразе старых клеток могут возникать ошибки, которые отрицательно сказываются на скорости деления. В структуре некоторых других ферментов, изученных к настоящему времени (в их числе РНК-полимераза), ошибки не обнаружены; это свидетельствует о том, что аминокислотные последовательности данных ферментов не изменяются при переходе клеток из фазы II в фазу III [13, 15, 30] (другие ссылки см. в гл. 9). Таким образом, наблюдаемое ослабление пролиферации, по-видимому, обусловлено только постепенным снижением синтеза ДНК-полимеразы.

Рис. 8.2. Зависимость количества клеток штамма WI-44 от длительности культивирования [24]. В течение первых 40 пассажей число клеток остается практически постоянным и составляет около 6·10⁶ на каждый пассаж при частоте субкультивирования 2:1. Начиная с 45-го пассажа, число клеток логарифмически падает (фаза III)

Таблица 8.1. Метаболические и клеточные параметры, которые снижаются, повышаются или не изменяются при старении интактных фибробластов человека in vitro [26]

Возрастные изменения клеток в культуре

С целью исследования причин старения организма было предпринято изучение старения клеток в культуре. Как впервые показали Свим и Паркер [48], фибробласты, полученные из различных тканей человека, пролиферируют только в течение ограниченного времени, после чего погибают. Эти авторы, однако, не выяснили, сохраняют ли клетки в культуре свои нормальные свойства, и не осмелились предположить, что их ограниченная пролиферативная активность связана со старением. Позже аналогичные работы были широко развернуты в лаборатории Хейфлика. Хейфлик и Мурхед [27] установили, что легочные фибробласты эмбриона человека проходят в культуре около 50 удвоений популяции и затем погибают. Фибробласты, полученные из легочной ткани взрослого донора, подвергаются только ~20 удвоениям популяции [24]. Хейфлик предположил, что имеется обратная зависимость между возрастом донора и пролиферативным потенциалом фибробластов. Позже другие исследователи [18, 34, 37, 43, 45] также сообщили о наличии такой связи (рис. 8.3). Более того, было показано, что при культивировании фибробластов кожи, полученных от людей в возрасте 10–90 лет, наблюдается снижение потенциала удвоения примерно на 0,20 относительные единицы в расчете на каждый год жизни донора. Коэффициент регрессии составляет -0,20 [37]. Сообщение Голдстейна и др. [19] о том, что не хронологический возраст донора, а скорее его физиологическое состояние ответственно за скорость роста фибробластов, побудило многих авторов проделать скрупулезную работу с клетками разных типов, чтобы установить, действительно ли существует линейная связь между хронологическим возрастом и удвоением популяции. Изучение культур фибробластов, источником которых служили клетки тщательно отобранных здоровых доноров, не предрасположенных к диабету, дало отрицательный результат: обратная зависимость между возрастам донора и числом удвоений популяции не была обнаружена. В то же время эта зависимость была установлена для культур клеток, полученных от больных диабетом или от лиц, генетически предрасположенных к этому заболеванию. Таким образом, именно физиологическое состояние в большей степени, чем хронологический возраст, определяет пролиферативную активность клеток.

Рис. 8.3. Зависимость максимального числа удвоений популяции фибробластов человека от возраста донора [37]. Средние значения для каждого десятилетия обозначены горизонтальными черточками. Коэффициент линии регрессии составляет -0,20 (±0,5 S.D) клеточных удвоений в год; коэффициент корреляции равен 0,5

Можно ожидать, что фибробласты больных прогерией (синдром Хатчинсона — Гилфорда) и с синдромом Вернера, заболеваниями, для которых характерно ускоренное старение, должны иметь сниженную пролиферативную активность. Прогерия — редкое генетическое заболевание человека, при котором наблюдается замедление роста и атеросклероз всех крупных кровеносных сосудов, включая аорту и коронарную артерию, уже в 9-летнем возрасте [40], а также значительное отложение возрастного пигмента липофусцина в клетках многих органов. Картина преждевременного старения выражена очень ярко, и ребенок в возрасте 9 лет напоминает 70-летнего человека. Больные остаются бесплодными и умирают, не достигнув 20 лет. Синдром Вернера является сходным заболеванием, но его симптомы развиваются позже; больные тоже имеют сниженную продолжительность жизни, в среднем около 47 лет. Заболевание носит генетический характер, оно контролируется аутосомным генам. Основные симптомы: высокая частота злокачественных новообразований, ранняя потеря и поседение волос, малый рост, юношеская катаракта, склонность к диабету, ранний атеросклероз, кальцификация кровеносных сосудов и остеопороз.

Фибробласты, полученные от 9-летних больных прогерией, проходят в культуре только 2–4 удвоения популяции, т. е. существенно меньше, чем клетки, полученные от здоровых детей того же возраста. Снижен синтез ДНК и эффективность клонирования [16, 17]. Антигенные маркеры HLA, имеющиеся на поверхности фибробластов здоровых людей, отсутствуют на фибробластах больных прогерией. Фибробласты больных с синдромом Вернера также обладают сниженным потенциалом удвоения [37]. Эти данные показывают, что скорее физиологическое состояние, а не хронологический возраст определяет способность клеток к пролиферации [19]. Более того, ускоренное старение организма отражается в ускоренном старении клеток in vitro, о чем свидетельствует изменение скорости деления и метаболизма.

Известно, что если клетки заморозить при температуре ниже нуля после того, как они просуществовали в культуре некоторое время, например прошли 20 удвоений популяции, а затем вернуть их к жизни при 37 °C, то они возобновляют деление и "доживают свой век", проходя еще около 30 удвоений популяции. Это указывает на постоянство потенциала деления клеток данного типа, который не зависит от времени, необходимого для завершения полного цикла делений. Фибробласты человека штамма WI-38, замороженные в жидком азоте на 14 лет, после возобновления размножения завершили общий цикл деления, который составил 50±10 удвоений популяции [25].

Был измерен потенциал деления клеток различных типов. Мартин и др. [37] показали, что фибробласты кожи эмбриона человека проходят 45 удвоений популяции, тогда как клетки скелетной мышцы и костного мозга — значительно меньше. Кроме того, выяснили, что клетки почки, сердца, тимуса, щитовидной железы [27] и печени [34] живут в культуре меньше, чем клетки легкого. Следовательно, пролиферативная активность клеток различных типов неодинакова. Зависит ли это от характера и степени их дифференцировки, пока неизвестно. Хотя клетки костного мозга и эпителия продолжают делиться в организме на протяжении всей жизни, их пролиферативная способность in vitro ограничена. В этой связи было бы важно узнать не только то, почему эти клетки имеют пониженный потенциал деления, но также и то, не делились ли они уже до помещения их в культуру. Такие исследования могут дать полезную информацию о том, почему клетки типа нейронов, скелетной и сердечной мышц прекращают деление на ранней стадии развития.