Предварительно приготовленный согласно инструкции, прила­гаемой к набору, исследуемый материал (сыворотка, плазма) вно­сится в лунку планшета. Если этого требует методика, планшет пред­варительно отмывается. Несколько лунок планшета заполняют кон­трольными сыворотками, содержащими и не содержащими антите­ла к ВИЧ. При работе с контрольными сыворотками необходимо строго соблюдать инструкции по применению диагностической тест-системы, т. к. интерпретация результатов зависит от значений опти­ческой плотности контрольных сывороток. Планшет с внесенными контрольными сыворотками и исследуемым материалом инкубиру­ется при условиях, указанных в инструкции, прилагаемой к диагностическому набору. Если специфические антитела присутствуют в сыворотке, они образуют комплекс с антигеном, сорбированным на поверхности лунок планшета. Несвязавшиеся с антигеном анти­тела удаляются при отмывке планшета.

Затем во все лунки планшета вносят конъюгат-антитела против иммуноглобулинов человека, меченные ферментом (пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.). При последующей инкубации происхо­дит образование комплекса антиген – антитело – конъюгат. Несвя­завшийся конъюгат удаляется во время отмывки планшета. Наибо­лее широко применяемым индикаторным ферментом для ИФА слу­жит пероксидаза хрена. Субстраюм для нее служит перекись водо­рода.

Эта реакция протекает без видимых проявлений. Изменение ок­раски раствора происходит при окислении красителей (ортофени-лендиамина или др.), которые входят в состав субстратного раство­ра. Краситель из восстановленной формы переходит в окисленную окрашенную форму. Таким образом происходит окрашивание толь­ко тех лунок, в которых присутствует комплекс антиген – антите­ло – конъюгат. Иногда окрашивание может быть результатом не­специфического связывания иммуноглобулинов с антигенами ВИЧ. Учет реакции проводят на спектрофотометре (ридере) при длине волны, указанной в инструкции, прилагаемой к диагностическому набору. Длина волны зависит от красителя, используемого в тест-системе.

При постановке ИФА в случае получения положительного ре­зультата анализ проводится еще 2 раза (с той же сывороткой). При получении хотя бы еще одного положительного результата сыво­ротки направляют в референс-лабораторию.

Иммунный блоттинг.

В настоящее время для подтверждения специфичности первично­го положительного результата чаше всего используется метод иммунноблоттинга. Принцип метода заключается в выявлении анти­тел к определенным белкам вируса, иммобилизованным на нитроцеллюлозную мембрану. В организме человека образуются антитела к ряду компонентов вируса.

Подготовка нитроцеллюлозных мембран для тест-системы про­изводится следующим образом. На первом этапе производят разде­ление белков ВИЧ по молекулярной массе с помощью электрофо­реза в полиакриламидном геле. Белки мигрируют в слоях геля при наложении электрического потенциала: белки с низкой молекуляр­ной массой проходят через поры в полиакриламидном геле легче, чем белки с высокой молекулярной массой и быстрее достигают конца геля. В результате этого происходит разделение белков на отдельные полосы по молекулярной массе. Затем осуществляется электрофоретический перенос из полиакриламидного геля на поверх­ность нитроцеллюлозной мембраны. После этого мембрану обраба­тывают блокирующим раствором во избежание неспецифического связывания иммуноглобулинов сыворотки крови, затем отмывают, высушивают и разрезают на отдельные полоски, которые вклады­ваются в набор. Перенесенные таким образом белки выявляются на нитроцеллюлозной реплике (блоте) с помощью непрямого анали­за, а именно: сыворотка или плазма инкубируются с блотом; если исследуемый материал содержит антитела к белкам ВИЧ, они свя­зываются с антигеном, перенесенным на нитроцеллюлозную мемб­рану, после отмывки полоски блота инкубируются с конъюгатом; при образовании комплекса антиген – антитело, конъюгат присое­диняется к нему, после отмывки от конъюгата и инкубации с суб­стратом происходит окрашивания тех участков нитроцеллюлозы, где произошло образование комплекса антиген – антитело – конъ­югат. Полученный результат сравнивается с результатами тестиро­вания положительной и отрицательной контрольных сывороток.

Результаты, полученные в иммунном блоттинге интерпретиру­ются как положительные, сомнительные и отрицательные.

Основные принципы терапии больных ВИЧ-инфекцией.

Создание охранительного психологического режима. Своевремен­ное начало этиотропной терапии. Тщательный выбор лекарственных препаратов с подбором необходимого минимума. Ранняя диагности­ка вторичных заболеваний и их своевременное лечение.

Задачи:

На стадии первичных проявлений и в периоды ремиссии на ста­дии вторичных заболеваний предотвратить или отсрочить развитие угрожающих жизни поражений.

На стадии вторичных заболеваний, особенно ЗБ, 3В, в период клинической манифестации с помощью рациональной терапии вто­ричных заболеваний продержать больного до момента, когда с по­мощью специфической противоретровирусной терапии (АЗТ) удас­тся добиться временного восстановления иммунного статуса орга­низма.

Этиотропная терапия.

Базисная этиотропная терапия больных ВИЧ-инфекцией вклю­чает противоретровирусную терапию (направленную на подавление репликации ВИЧ) и химиопрофилактику вторичных заболеваний.

Противоретровирусная терапия.

Препаратом для этиотропной терапии ВИЧ-инфекции, разре­шенным для клинического применения в России является азидотимидин (АЗТ, AZT), который выпускается под коммерческими на­званиями тимозид (Ассоциация «АЗТ», Россия) в капсулах по 0,1 г., и Retrovir, Zidovudine (Wellcome, Великобритания) в капсулах по 0,1 г и 0,25 г, в форме сиропа. Препарат применяется перорально в суточной дозе 0,6 г (детям из расчета 0,01 г/кг) в 3 приема. При обусловленных ВИЧ поражениях нервной системы доза удваивается. При плохой переносимости препарата суточная доза может быть снижена до 0,3 г. Более низкие дозы неэффективны. В форме сиропа препарат назначается больным, которые не могут глотать капсулы (маленькие дети, больные с эзофагитом). АЗТ назначается по не­прерывной схеме или курсами продолжительностью не менее 3 мес. Во избежание развития анемии и нейтропении лечение АЗТ прово­дится под контролем общего анализа крови, проводимого каждые 2 нед первые 2 мес лечения и в последующем ежемесячно.

Противоретровирусная терапия назначается по клиническим по­казаниям в стадии 2А, ЗА, 3В, 3В в период клинической активнос­ти до исчезновения клинической симптоматики, но не менее, чем на 3 мес.

При отсутствии клинической симптоматики (т. е. в период кли­нической ремиссии) проводится поддерживающая Противоретрови­русная терапия, назначаемая по клиническим и иммунологическим показаниям. При уровне CD4"200 она проводится по непрерывной схеме, при CD4"500, но "200 – курсами по 3 мес с 3-месячными интервалами. При неизвестном уровне CD4 в стадии первичных про­явлений (2) и в стадии ЗА поддерживающая терапия не проводит­ся, в стадии ЗБ проводится по курсовой и в стадии 3В по непрерыв­ной схеме.

Вакцинопрофилактика у пациентов с ВИЧ-инфекцией Вакцинация осуществляется под наблюдением врачей-педиатров Центров борьбы со СПИД. В поствакцинальном периоде проводится патронаж ребенка на 3-4-е и 10-11-е сутки. При возможности, осу­ществляется госпитализация ребенка в поствакцинальном периоде. Перед вакцинацией за 1-2 нед целесообразно назначать поливита­мины, содержащие витамин А.

Профилактика вторичных заболеваний.

Профилактика вторичных заболеваний у больных ВИЧ-инфекцией проводится по эпидемиологическим, клиническим и иммуно­логическим показаниям.

Профилактика пневмоцистной пневмонии:

Профилактика пневмоцистной пневмонии проводится больным ВИЧ-инфекцией с уровнем CD4 лимфоцитов ниже 200 в мм? (пер­вичная профилактика) и больным, ранее перенесшим пневмоцистную пневмонию (вторичная профилактика). При неизвестном уров­не CD4 профилактика пневмоцистной пневмонии проводится боль­ным в стадии ЗБ в период клинической активности при наличии легочной патологии, а также всем больным в стадии 3В. Препаратом первого ряда является Trimetoprim+Sulfamethoxazole (Biseptol 480 или Septrin У2Вдля взрослых, Biseptol 120, Septrin H4B для детей). Для первичной профилактики назначают 3 дня подряд каждую не­делю по 1 таблетке взрослым, детям – уменьшенную дозу соответ­ственно массе тела.