В клетке организма «цехом окончательной сборки» белков является удивительная структура, получившая название шаперон. О работе шаперонов и их устройстве мы знаем не так уж много. Известно, что они обладают потрясающим быстродействием, учитывая сложность выполняемых функций. Их «конструкция» очень сложна. Существует мнение, что в структуре шаперонов каким-то образом записан «чертеж» собираемой молекулы белка, но достоверно мы об этом не знаем. Зато известно, что кроме укладки молекул шапероны способны «ремонтировать» неправильно скомпактифицированные белки, если их структура под влиянием каких-то внешних воздействий будет повреждена.
Так же, как в только что использованной нами реакции обратной транскрипции, основным компонентом ПЦР является фермент – выделенная из бактерий, живущих в горячих источниках, термостабильная ДНК-полимераза. Подобно ревертазе, ДНК-полимераза синтезирует молекулу ДНК, присоединяя отдельные нуклеотиды к затравке комплиментарно матрице, только в качестве матрицы на сей раз используется ДНК, а не РНК. ДНК-полимеразы есть у всех животных (собственно, они необходимы для удвоения ДНК при делении клеток), особенностью же термостабильной полимеразы является ее способность работать при высокой температуре.
Для проведения полимеразной цепной реакции добавим к одноцепочечной кДНК полимеразу, оптимизированный для ее работы солевой буфер, смесь нуклеотидов и два праймера, соответствующих добавленным на концы кДНК адаптерам. Теперь нам понадобится специальная лабораторная установка – амплификатор. Несмотря на свою дороговизну (а стоит такой прибор как автомобиль) амплификатор представляет собой всего лишь хороший программируемый термостат, способный быстро менять температуру. Ставим пробирку в амплификатор и запускаем программу: прибор должен сначала прогреть раствор до 95 °С, затем снизить температуру до 60 °С, затем подержать пару минут 72 °С и начать все с начала. В принципе, вместо амплификатора можно использовать три термоса с подогретой водой – раньше так и делали, только рука устает пробирку переносить. Давайте теперь посмотрим, что же будет происходить в нашей смеси.
При температуре 95 °С цепочки ДНК и РНК отходят друг от друга. РНК нас больше не интересует, скорее всего она развалится в ближайшее время. Когда температура опускается до 60 °С, один из праймеров прилипает к соответствующей ему нуклеотидной последовательности адаптера на конце молекулы ДНК. При последующем повышении температуры до 72 °С начинает работать термостабильная ДНК-полимераза – мы как раз достигли оптимальной для этого фермента температуры. Полимераза «садится» на прилипший праймер и, перемещаясь по молекуле, начинает присоединять к ней нуклеотиды.
За первый цикл полимеразной цепной реакции ДНК-полимераза построила комплиментарные цепи для каждой одноцепочечной молекулы кДНК, находящейся в реакционной смеси. Теперь мы получили полноценную двухцепочечную ДНК, но завершать реакцию пока рано – нам необходимо наработать больше материала. ПЦР продолжается: 95 °С – цепи ДНК расходятся; 60 °С – праймеры садятся на ДНК; 72 °С – полимераза достраивает праймеры, превращая их в новые цепи ДНК. За каждый цикл количество ДНК в пробирке удваивается; таким образом, за двадцать циклов ПЦР для каждой молекулы ДНК мы получаем 220 точных копий. Вся работа заняла около часа, ксероксам подобные скорости и не снились. Итак, мы имеем достаточно ДНК, а главное, всегда сможем дополнительно ее амплифицировать, проведя еще одну полимеразную цепную реакцию.
Теперь в нашей пробирке плавает не меньше миллиона копий гена зеленого флуоресцентного белка. Однако в том же растворе находятся еще миллиарды копий других молекул ДНК, и нам надо как-то «отделить зерна от плевел». Мы уже знаем, что физико-химические методы здесь не годятся: разные молекулы ДНК слишком похожи друг на друга. Для поиска гена зеленого флуоресцентного белка мы воспользуемся главным свойством именно этого белка – флуоресценцией.
Все имеющиеся в растворе гены коралла мы введем в бактерии так, чтобы каждая из них получила один ген. Бактерии в норме «не умеют» флуоресцировать – если мы найдем флуоресцентную бактерию, значит, внутри нее работает (экспрессируется) ген флуоресцентного белка из коралла. Молекулярные биологи часто используют в своих целях лабораторные штаммы кишечной палочки E. coli (эти бактерии относительно безопасны для человека, какое-то их количество всегда присутствует в нашем кишечнике).
Отличительной чертой бактерий является то, что часть генетической информации у них содержится в коротких кольцевых молекулах ДНК – плазмидах. Многие биотехнологические компании торгуют очищенными плазмидами (векторами), специально предназначенными для решения разных молекулярно-технологических задач. Нам необходимо купить или попросить у знакомых биологов вектор для экспрессии чужеродных генов в бактериях, вставить в него нашу кДНК и перенести полученную конструкцию в бактерию.
Чтобы все это сделать, мы должны сначала разрезать кольцевую молекулу ДНК вектора. Для этого используются специальные ферменты – рестриктазы, сама реакция называется рестрикцией. В природе рестриктазы используются бактериями для защиты от чужеродной ДНК; генному инженеру набор рестриктаз, хранящийся в морозильнике, столь же необходим, как ножницы портному. Рестриктазы узнают и разрезают строго определенные нуклеотидные последовательности, которые называются сайтами рестрикции. Для каждой рестриктазы есть свой сайт узнавания ДНК, обычно включающий в себя от четырех до восьми расположенных подряд нуклеотидов. Вектора, предназначенные для клонирования, содержат специальный полилинкер – десяток идущих друг за другом разных сайтов рестрикции, перед которым находится промотор – последовательность нуклеотидов, с которой бактерии начинают считывать РНК любого гена.
«Технический контроль» и отбраковку неправильно изготовленных белковых молекул осуществляют опять-таки белки. Обнаруживает дефектные молекулы белок паркин, который «навешивает» на них специальные «бирки» – что-то вроде табличек «Брак!». Эти «бирки» – цепочки молекул убиквитина, прикрепленные к «неисправным» белкам, – являются инициаторами начала работы белковых структур под названием протеосомы.
Протеосомы выполняют функции «баз разделки» (такие существуют на флоте и в авиации), где разбирают на запчасти и режут на металлолом отслужившие свой срок корабли и самолеты. Аналогично «поступают» и протеосомы. Помеченные убиквитином белковые молекулы они «разбирают на запчасти» – деструктурируют до отдельных аминокислот, которые могут быть вновь использованы для «производства» любых других белковых молекул.
Добавим к выбранному нами вектору рестриктазу и подходящий для ее работы солевой раствор (он прилагается к купленному ферменту) и поставим пробирку в термостат, разогретый до 37 °С. Через час все кольцевые молекулы вектора в растворе станут линейными – рестриктаза нашла свой сайт на полилинкере и разрезала в этом месте ДНК. Теперь смешаем разрезанный вектор и кДНК и добавим новый фермент – лигазу. Если рестриктаза играет в нашей работе роль ножниц, то лигаза, наоборот, является иголкой, сшивающей две молекулы ДНК. Спустя несколько часов все молекулы вектора снова станут кольцевыми, но теперь внутри полилинкера в каждой из них будет содержатся по одной молекуле кДНК. Правда, некоторые молекулы вектора «зашились» обратно сами на себя – для борьбы с этим явлением существуют специальные способы, но мы сейчас обойдемся без них, просто возьмем в следующую стадию побольше ДНК и будем надеяться на лучшее.
Мы достигли кульминационной части первого этапа работы – в нашей пробирке находится смесь молекул кДНК коралла, среди которых и ген зеленого флуоресцентного белка. Осталось поместить все эти молекулы в бактерии (такая процедура называется трансформацией) и посмотреть, что получится.
