В 1894 году, когда Рентген был избран ректором университета, он приступил к экспериментальным исследованиям электрического разряда в стеклянных вакуумных трубках. Вечером 8 ноября 1895 года Рентген, как обычно, работал в своей лаборатории, занимаясь изучением катодных лучей. Около полуночи, почувствовав усталость, он собрался уходить. Окинув взглядом лабораторию, погасил свет и хотел было закрыть дверь, как вдруг заметил в темноте какое-то светящееся пятно. Оказывается, светился экран из синеродистого бария. Почему он светится? Солнце давно зашло, электрический свет не мог вызвать свечения, катодная трубка выключена, да и, вдобавок, закрыта чёрным чехлом из картона. Рентген ещё раз посмотрел на катодную трубку и упрекнул себя, ведь он забыл её выключить. Нащупав рубильник, учёный выключил трубку. Исчезло и свечение экрана; включал трубку, вновь и вновь появлялось свечение. Значит свечение вызывает катодная трубка! Но каким образом? Ведь катодные лучи задерживаются чехлом, да и воздушный метровый промежуток между трубкой и экраном для них является бронёй. Так началось рождение открытия.
Оправившись от минутного изумления. Рентген начал изучать обнаруженное явление и новые лучи, названные им икс-лучами. Оставив футляр на трубке, чтобы катодные лучи были закрыты, он с экраном в руках начал двигаться по лаборатории. Оказалось, что полтора-два метра для этих неизвестных лучей не преграда. Они легко проникают через книгу, стекло, станиоль… А когда рука учёного оказалась на пути неизвестных лучей, он увидел на экране силуэт её костей! Фантастично и жутковато! Но это только минута, ибо следующим шагом Рентгена был шаг к шкафу, где лежали фотопластинки, т. к. надо было увиденное закрепить на снимке. Так начался новый ночной эксперимент. Учёный обнаруживает, что лучи засвечивают пластинку, что они не расходятся сферически вокруг трубки, а имеют определённое направление…
Утром обессиленный Рентген ушёл домой, чтобы немного передохнуть, а потом вновь начать работать с неизвестными лучами. Пятьдесят суток (дней и ночей) были принесены на алтарь небывалого по темпам и глубине исследования. Были забыты на это время семья, здоровье, ученики и студенты. Он никого не посвящал в свою работу до тех пор, пока не разобрался во всём сам. Первым человеком, кому Рентген продемонстрировал своё открытие, была его жена Берта. Именно снимок её кисти, с обручальным кольцом на пальце, был приложен к статье Рентгена «О новом роде лучей», которую он 28 декабря 1895 году направил председателю Физико-медицинского общества университета. Статья была быстро выпущена в виде отдельной брошюры, и Рентген разослал её ведущим физикам Европы.
Первое сообщение об исследованиях Рентгена, опубликованное в местном научном журнале в конце 1895 года, вызвало огромный интерес и в научных кругах, и у широкой публики. «Вскоре мы обнаружили, — писал Рентген, — что все тела прозрачны для этих лучей, хотя и в весьма различной степени». А 20 января 1896 года американские врачи с помощью лучей Рентгена уже впервые увидели перелом руки человека. С тех пор открытие немецкого физика навсегда вошло в арсенал медицины.
Открытие Рентгена вызвало огромный интерес в научном мире. Его опыты были повторены почти во всех лабораториях мира. В Москве их повторил П. Н. Лебедев. В Петербурге изобретатель радио А. С. Попов экспериментировал с икс-лучами, демонстрировал их на публичных лекциях, получая различные рентгенограммы. В Кембридже Д. Д. Томсон немедленно применил ионизирующее действие рентгеновских лучей для изучения прохождения электричества через газы. Его исследования привели к открытию электрона.
Рентген опубликовал ещё две статьи об икс-лучах в 1896 и 1897 годах, но затем его интересы переместились в другие области. Медики сразу оценили значение рентгеновского излучения для диагностики. В то же время икс-лучи стали сенсацией, о которой раструбили по всему миру газеты и журналы, нередко подавая материалы на истерической ноте или с комическим оттенком.
Росла слава Рентгена, но учёный относился к ней с полнейшим равнодушием. Рентгена раздражала внезапно свалившаяся на него известность, отрывавшая у него драгоценное время и мешавшая дальнейшим экспериментальным исследованиям. По этой причине он стал редко выступать с публикациями статей, хотя и не прекращал это делать полностью: за свою жизнь Рентген написал 58 статей. В 1921 году, когда ему было 76 лет, он опубликовал статью об электропроводимости кристаллов.
Учёный не стал брать патент на своё открытие, отказался от почётной, высокооплачиваемой должности члена академии наук, от кафедры физики в Берлинском университете, от дворянского звания. Вдобавок ко всему он умудрился восстановить против себя самого кайзера Германии Вильгельма II.
В 1899 году, вскоре после закрытия кафедры физики в Лейпцигском университете. Рентген стал профессором физики и директором Физического института при Мюнхенском университете. Находясь в Мюнхене, Рентген узнал о том, что он стал первым лауреатом Нобелевской премии 1901 года по физике «в знак признания необычайно важных заслуг перед наукой, выразившихся в открытии замечательных лучей, названных впоследствии в его честь». При презентации лауреата К. Т. Одхнер, член Шведской королевской академии наук, сказал: «Нет сомнения в том, сколь большого успеха достигнет физическая наука, когда эта неведомая раньше форма энергии будет достаточно исследована». Затем Одхнер напомнил собравшимся о том, что рентгеновские лучи уже нашли многочисленные практические приложения в медицине.
Эту награду принял Рентген с радостью и волнением, но из-за своей застенчивости отказался от каких-либо публичных выступлений.
Хотя самим Рентгеном и другими учёными много было сделано по изучению свойств открытых лучей, однако природа их долгое время оставалась неясной. Но вот в июне 1912 года в Мюнхенском университете, где с 1900 года работал Рентген, М. Лауэ, В. Фридрихом и П. Книппингом была открыта интерференция и дифракция рентгеновских лучей, что доказывало их волновую природу. Когда обрадованные ученики прибежали к своему учителю, их ждал холодный приём. Рентген просто не поверил во все эти сказки про интерференцию; раз он сам не нашёл её в своё время, значит, её нет. Но молодые учёные уже привыкли к странностям своего шефа и решили, что сейчас лучше не спорить с ним, пройдёт некоторое время и Рентген сам признает свою неправоту, ведь у всех в памяти была свежа история с электроном.
Рентген долгое время не только не верил в существование электрона, но даже запретил в своём физическом институте упоминать это слово. И только в мае 1905 года, зная, что его русский ученик А. Ф. Иоффе на защите докторской диссертации будет говорить на запрещённую тему, он, как бы между прочим, спросил его: «А вы верите, что существуют шарики, которые расплющиваются, когда движутся?» Иоффе ответил: «Да, я уверен, что они существуют, но мы не всё о них знаем, а следовательно, надо их изучать». Достоинство великих людей не в их странностях, а в умении работать и признавать свою неправоту. Через два года в Мюнхенском физическом институте было снято «электронное табу». Более того, Рентген, словно желая искупить свою вину, пригласил на кафедру теоретической физики самого Лоренца — создателя электронной теории, но учёный не смог принять это предложение.
А дифракция рентгеновских лучей вскоре стала не просто достоянием физиков, а положила начало новому, очень сильному методу исследования структуры вещества — рентгеноструктурному анализу. В 1914 году М. Лауэ за открытие дифракции рентгеновских лучей, а в 1915 году отец и сын Брэгги за изучение структуры кристаллов с помощью этих лучей стали лауреатами Нобелевской премии по физике. В настоящее время известно, что рентгеновские лучи — это коротковолновое электромагнитное излучение с большой проникающей способностью.
Рентген был вполне удовлетворён сознанием того, что его открытие имеет столь большое значение для медицины. Помимо Нобелевской премии он был удостоен многих наград, в том числе медали Румфорда Лондонского королевского общества, золотой медали Барнарда за выдающиеся заслуги перед наукой Колумбийского университета, и состоял почётным членом и членом-корреспондентом научных обществ многих стран.